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El patch-clamp es la técnica por excelencia para el estudio de canales iónicos. En el LaNCa contamos con equipos manuales y automatizados para la obtención de registros electrofisiológicos en una variedad de células en cultivo, todo bajo las condiciones más cercanas a lo fisiológico. Nosotros tenemos experiencia en registros de patch-clamp, así como imagenología de calcio intracelular, que nos permiten determinar los efectos de diversas moléculas sobre diversos canales iónicos.
Nuestros servicios están centrados en registros in vitro sobre canales iónicos o receptores expresados:
de forma estable o transitoria en sistemas de expresión heterólogo (ej. hERG y Nav1.7).
de forma nativa en neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal (DRGs), del trigémino (TG) y del ganglio nodoso (NG).
de forma nativa en diversas líneas celulares (ej. células tumorales, endoteliales, musculares).
De esta forma nuestros servicios pueden dar soporte farmacológico a diversas áreas, como las relacionadas con el dolor, la oncología, cardiología, por mencionar algunas.
Nuestras técnicas para el estudio de canales iónicos incluyen:
Patch-clamp (manual o automatizado) tanto en la modalidad de fijación de corriente y fijación de voltaje.
Fluorimetría de calcio intracelular (Fluo4-AM).
Ensayos de fluorescencia de alto desempeño para la búsqueda de moduladores de canales iónicos.
Búsqueda de moduladores sobre el Kv11.1 (hERG)
Búsqueda de moduladores sobre el Kv11.1 (hERG)
La cardiotoxicidad es uno de los puntos claves al momento de posicionar fármacos en la clínica, y es la principal razón por la que muchos de éstos nunca llegan a comercializarse. Los cardiomiocitos expresan el canal de potasio Kv11.1 o hERG, el cual es un canal clave en la repolarización del potencial de acción cardiaco. Muchas de las drogas pueden tener efectos sobre el canal hERG desencadenando algo que se conoce en la clínica como síndrome de QT largo, es cual puede desencadenar arritmias cardiacas fatales. Dado los efecto adversos desencadenados por la unión de fármacos sobre el hERG, los ensayos farmacológicos sobre este canal son prioritarios.
Nuestros servicios incluyen la caracterización farmacológica de compuestos sobre el canal de potasio activado por voltaje Kv11.1 (hERG). El laboratorio cuenta con la línea celular con expresión estable del canal (HEK-Kv11.1). La actividad del canal Kv11.1 puede ser evaluada a través de:
Ensayos de fluorescencia asociados a cambios en el potencial de membrana. Figura inferior izquierda y central.
Ensayos de patch-clamp en la modalidad de célula completa. Figura inferior derecha.
Cultivos primarios de neuronas
Cultivos primarios de neuronas
Las neuronas sensoriales aisladas de los ganglios de la raíz dorsal, del ganglio trigémino y del ganglio nodoso son una herramienta importante en estudios sobre los mecanismos moleculares que hacen posible la detección de estímulos físicos y químicos a los cuales nos encontramos sometidos, tanto en el rango no nocivo como nocivo (dolor).
Nosotros utilizamos la técnica de patch-clamp para registrar corrientes iónicas (activadas por voltaje o por ligando) y potenciales de acción. Nuestras mediciones incluyen cambios en la morfología del potencial de acción, la frecuencia de descarga, así como algunas propiedades de membrana. Además, podemos realizar curvas dosis-efecto de moléculas o compuestos de interés con actividad sobre canales iónicos.
Imagen de Calcio
El patch-clamp en combinacion con imagenología de calcio es un herramienta muy poderosa para evaluar cambios en la excitabilidad neuronal. En el LaNCa contamos con un sistema para hacer registros de imagenología de calcio intracelular (usando Fluo4-AM) para evaluar la acción de diversos compuestos sobre las diversas subpoblaciones sensoriales encontradas en los ganglios de la raíz dorsal, en neurona trigeminales y del ganglio nodoso.
En el ejemplo de la izquierda podemos observar neuronas aisladas de los ganglios de la raiz dorsal que responden a capsaicina (el componente activo de los chiles picantes) y que ayuda a definir una subpoblación de neuronas sensoriales que expresan el canal iónico TRPV1.
Búsqueda de moduladores sobre el Nav1.7
Búsqueda de moduladores sobre el Nav1.7
El canal de sodio activado por voltaje Nav1.7 se expresa principalmente en sistema nervioso periférico y neuronas simpáticas. Este canal, sensible a la tetrodotoxina, juega un papel muy importante en la nocicepción (detección de estímulos dolorosos) a través de la regulación de la excitabilidad neuronal. Mutaciones que llevan a ganancia o pérdida de función de canal conducen al desarrollo de síndromes que pueden producir una sensación de dolor exacerbada o bien insensibilidad al dolor, respectivamente. Dichos síndromes ponen de manifiesto el papel del canal en la nocicepción, volviendolo un blanco molecular para tratar algunas patologías caracterizadas por dolor no fisiológico.
En el lanca contamos con la línea celular HEK293 con expresión inducible del canal Nav1.7 de humano el cual tiene fusionada la proteína verde fluorescente (GFP) a su C-terminal (imagen a la izquierda).
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